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    公开号:WO1988002861A1
    申请号:PCT/CH1987/000122
    申请日:1987-09-24
    公开日:1988-04-21
    发明作者:Ernst Buergisser
    申请人:Anawa Laboratorien Ag；
    IPC主号:G01N33-00
    专利说明:
    [0001] VERFAHREN ZUR HERSTELLUNG EINER REZEPTORPRAEPARATION FUER EINEN RADIOREZEPTOR-ASSAY UND KITGERECHTER RADIOREZEPTOR- ASSAY GEMAESS VERFAHREN.
    [0002] Die Erfindung liegt auf dem Gebiet der biochemischen Analysemethoden und betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer stabilen Rezeptorpräparation fuer einen stabilen (Mehrkomponenten-) Radiorezeptoir-Assay und den mit diesem Verfahren erzielten Radiorezeptor-Assay, dessen Kit und die Verwendung des Kits bzw. des Assays.
    [0003] Gleich wie bei einem Radioimmunoassay beruht das Prinzip des Radiorezeptorassays auf der biospezifischen Erkennung eines ( für den Assay gezielt eingesetzten) Liganden, bspw. ein Hormon, ein Pharmakon, ein Neurotransmitter etc., an das entsprechende Ziel- oder Empfängermolekül, bspw. ein Antikörper beim Radioimmunoassay oder ein Rezeptor beim Radiorezeptor-Assay. Durch die radioaktive Markierung eines solchen gezielt eingesetzten Liganden, erhält man ein beobachtbares Molekül, den sogenannten Tracer, welcher in kompetitiver WechselWirkung mit nicht markierten Liganden und damit den gleichartigen aber nicht beobachtbaren Molekülen steht. Durch solche Massnahmen erhält man ein Testsystem, welches die Messung einer unbekannten Konzentration eines solchen Liganden erlaubt. Während der Radioimmunoassay zu einer vielverwendeten Routinemethode geworden ist und heute zu den in grossem Massstab verwendeten Analysemethoden gehört, wurde dagegen der Radiorezeptor-Assay für diesen Zweck nud selten benutzt.
    [0004] Dies liegt nicht zuletzt daran, dass die Handhabung von biologisch aktiven Rezeptoren um einiges heikler ist, als bei einem Antikörper. Die Voraussetzung für eine Routinemethode ist neben der verhäl tnismässig einfachen Handhabung (Einfachheit der Methode) und der damit einhergehenden Wirtschaftlichkeit vor allen Dingen die "Stabilität" der chemischen oder biologischen Reaktionspartner. Damit ist die Stabilität der Analysesubstanz an sich und ihre Stabilität innerhalb der Analysenreaktion im besonderen gemeint.
    [0005] Biologisch aktive Rezeptoren sind Jedoch in Lösung instabil und müssen daher eingefroren (fest) sein bis kurz vor den analytischen Einsatz. Dazu kommt, dass sie derart instabil sind, dass auch ein kurzer Ausfall dieser Bedingung den Rezeptor unbrauchbar machen kann. Es liegt wohl auf der Hand, dass solche sensiblen Eigenschaften geeignet sind, einem an und für sich brauchbaren Analysemechanismus den Einzug unter die Routinemethoden zu verwehren.
    [0006] Es ist daher das Ziel der Erfindung, einen Weg anzugeben, um diese empfindlichen Substanzen einer einfachen Routinemethode zu zuführen, welche Methode einfachst ausführbar ist, wobei die bisher verwendeten Massnahmen wie Einfrieren etc. mit all den Umständlichkeiten, Nachteilen und Risiken vermieden werden sollen. Dieses Ziel wird erreicht, durch das in den Patentansprüchen angegebene Herstellungsverfahren für einen Radiorezeptor- Assay und ein mit diesem Verfahren hergestellter Radiorezeptoi-Assay zum unmittelbaren Analyseeinsatz.
    [0007] Erreicht soll werden, dass sich alle oder möglichst vi e l e Reaktionspartner zusammen in einem gemeinsamen Gefäss befinden können und die Ingangsetzung der Bindungsreaktion mit möglichst einem einzigen Pipettierschritt durchgeführt wird, wobei ausser dem zu analysierenden Material alle Reaktionsteilnehmer in stabiler Form bspw. in einem Teströhrchen zur Verfügung stehen. Herkömmliche analoge Verfahren benötigen in der Regel 3 bis 4 Pipettierschritte, sodass der durch die Erfindung ermöglichte Einmalvorgang einen ökonomisch (bezgl. Geschwindigkeit der Testdurchführung, Präzision und Arbeitsaufwand) erheblichen Fortschritt in dieser Art Analysetechnik darstellt. Ausserdem kann durch die Erfindung ein Testkit geschaffen werden, der ohne Einbusse an Qualität bei Umgebungs- oder Kühlschranktemperatur (kein Einfrieren) gelagert werden kann, was u.a. besonders beim Transport von Wichtigkeit ist, da das bis anhin benötigte Trockeneis für den Transport entfällt.
    [0008] Das nachfolgend geschilderte Verfahren zur Herstellung eines stabilen Radiorezeptor-Assays, beschreibt das Vorgehen zur Erzielung einer getrockneten, stabilen Form desselben.
    [0009] Die Präparation von rezeptorhal tigen Plasmamembranen wird gemäss den in der Fachliteratur angegebenen Methoden durchgeführt, zum Beispiel gemäss Angaben E.Bürgisser et al., Biochem. Biophys. Res. Commun.,Bd. 133,p.1201-1209, 1985. Dies beinhaltet die Gewinnung von geeignetem Gewebematerial oder Zellen, z.B. Blutzellen oder Zellkulturen. Danach erfolgt ein Zeilaufschluss mittels Homogenisation, Ultraschall oder einer anderen geeigneten Vorgehensart, mit anschliessender Trennung von cytoplasmatischen (löslichen) Bestandteilen, sowie eine Separierung von gröberen Partikeln, bspw. durch zentrifugieren, filtrieren etc.. Die somit gewonnene Plasmamembranpräparation kann nun in einem RadiorezeptorAssay verwendet werden.
    [0010] Bis anhin wurde diese Präparation gleich für den Gebrauch in einem Assay hergestellt oder sie wurde tiefgefroren und im tiefgefrorenen Zustand bis zum Gebrauch aufbewahrt. Hier setzt nun das erfinderische Abweichen vom üblichen Vorgehen ein.
    [0011] An Stelle einer Haltbarmachung durch Tieffrieren wird die Präparation lyophilisiert, also gefriergetrocknet. Dieser Schritt führt jedoch nur dann zum Ziel, nämlich zur Erhaltung der biologischen Aktivität der Rezeptoren (das Erhalten ihrer Bindungsfähigkeit) in einem stabilen und wenig sensiblen Endprodukt, das nach beliebiger Zeitdauer eingesetzt werden kann, wenn der Membranpräparation geeignete Zusatzstoffe beigegeben werden. Eine Gefriertrocknung an und für sich führt nicht zum Gelingen, d.h., zu einem brauchbaren biologisch aktiven Analyseprodukt.
    [0012] Diese Zusatzstoffe sollen folgende Eigenschaften aufweisen:
    [0013] 1. Sie sollen chemisch und biochemisch inert sein, damit ist gemeint, dass sie keine Reaktionspartner des Testsystems sind und dieses nicht beeinflussen sollen. 2. Sie sollen eine möglichst geringe bis gar keine Hygroskopizität aufweisen.
    [0014] 3. Sie sollen in den für den Assay verwendeten Lösungsmitteln, also in den Lösungsmitteln, die zur Auflösung des lyophilisier tan Präparats verwendet werden, ebenfalls lösbar sein.
    [0015] 4. Fakultativ sollen sie ferner bewirken, dass das Lyophi lisat eine eher voluminöse und kompakte Masseform annimmt, welche, so sie direkt im Testgefäss lyophilisiert wird, auch bei grösserer mechanischer Einwirkung (Schütteln beim Postversand) fest mit der Gefässwand verbunden bleibt.
    [0016] Solche Substanzen sind:
    [0017] Zuckerverbindungen und deren Derivate, vorzugsweise Monosaccharide, wie Mannit, Glucose, Fructose, und weitere Aldosen und Ketosen, sowie Disaccharide wie Lactose, Saccharose, sowie schwach reak t ive Ami nosäuren wi e Gl yc i n e tc . und/oder zusätz l i ch Albumine, vorzugsweise bovines Serumalbumin. Ferner lösliche Polysaccharide und Kollagene, bspw. Gelatine.
    [0018] Beispiel 1 : Eine für die Lyophilisation von Plasmamembranen geeignete wässrige Lösung besteht bspw. aus
    [0019] -- Tris-Puffer 50 mM, pH 7.6 -- Bovines Serumalbumin 0.5% -- d-Mannit 2% -- Stabilisatoren Anteil gemäss System Die einzusetzenden Stabilisatoren sind hauptsächlich in Flüssigphase nötig, dies betrifft den Zustand der Präparation vor der Lyophilisierung und während der Inkubation in der Analyse. Bei Substanzen mit leichter Hygroskopizität besteht die Gefahr einer vorzeitigen partiellen Reaktion und/oder Degeneration im Lyophilisat. Die Stabilisatoren sind bspw. Proteaseninhibi toren, bspw. Aprotinin (Trasylol), Leupeptin etc. sowie Antioxydantien, bspw. Dithiothreitoi (DTT) etc. Bakteriostati ka, bspw. Natriumazid, Thimerosal und auch Komplexone, bspw. EDTA, EGTA. Ihr Einsatz hängt sehr stark vom jeweiligen Assay-System ab, das präpariert wird und sollte für jedes einzelne Testsystem evaluiert und optimiert werden. Die Kriterien dafür, entsprechen der üblichen Stabilisierung von biologisch aktiven Komponenten, wie sie in den herkömmlichen Verfahren bereits benutzt werden.
    [0020] Beispiel 2:
    [0021] -- Phosphatpuffer 50 mM, pH 7.4 -- Humanes Serumalbumin 0.2% -- Lactose 5% -- Glycerin 0.5 -- Natriumazid (Stabilisator) 0.01%
    [0022] Beispiel 3:
    [0023] -- HEPES-Puffer 28 mM, pH 7.4 -- Gelatine 1% -- Glycin 2% -- Komplexen III (EDTA) 2 mM
    [0024] Eine aus dem oben angegebenen Verfahren abgeleitete Variante ist folgende. Die Vereinfachung des Assays liegt in der Anwendung mittels eines möglichst einzigen (Pipettier-) Schrittes, bspw. das Umsetzen des Lyophilisats in flüssige reaktionsfähige Form. Besteht ein Kit aus mehreren Reaktionspartnern, so können durch Co-Lyophilisieren diese Reaktionsteilnehmer miteinbezogen werden. Die trockene Mischung wird dann mit der zu bestimmenden Probe aufgelöst und damit die Reaktion in Gang gesetzt. Vorteilhafterweise wird die Zusammensetzung in einem Teströhrchen oder Näpfchen von Mikrotestplatten in richtiger Menge und Zusammensetzung lyophilisiert.
    [0025] Um eine ungewollte Vorinkubation bei der Herstellung des Lyophilisats zu vermeiden, können die einzelnen Komponenten sequentiell im Reaktionsgefäss eingebracht werden. Dies geschieht bspw. folgendermassen: jede im Assay reaktive Komponente wird sequentiell im Testbehälter tiefgefroren, um eine Durchmischung in flüssiger Phase zu vermeiden. Vorteilhafterweise wird zwischen zwei reaktive Komponenten eine nichtreaktive Trennschicht gleichermassen eingeführt. Solche Trennschichten bestehen bspw. aus der in Bei spiel 1 beschriebenen Lösung oder Puffersubstanz. Diese Zugaben erfolgen direkt in den Testbehälter, welche den aliquotierten Assay enthalten soll und und dem Anwender zum direkten Verbrauch zur Verfügung gestellt wird. Das nachfolgende Lyophilisieren geschieht natürlich auch in diesen Testbehältern, welche anschliessend adäquat verpackt werden.
    [0026] Eine solche zur Co-Lyophilisierung vorbereitete Mischung besteht aus folgenden Teilen,
    [0027] Beispiel 4: (Co-Lyophilisat qualitativ)
    [0028] -- Plasmamembranpräparation -- Tracersubstanz - - evtl. ein Standard - - evtl. Stabilisatoren und/oder Modulatoren - - evtl. Farbstoffe zur visuellen Unterscheidung von verschiedenartig präparierten Tests. - - Lyophilisationsmedium gemäss Beispiel 1 oder Beispiel 2.
    [0029] Die Modulatoren beeinflussen die Bindungseigenschaften von Liganden an die Rezeptoren. Dafür werden die adäquaten Substanzen für jeden Assay jeweils augewählt. So verbessert bspw. die Substanz Amiloride die Bindungsaffinität von ANF an den Plasmamembranrezeptor aus bovinen Nebenni erenri nde (Lit. A.DeLean, Lif.sei. 39,1109-1116,1906).
    [0030] Beispiel 5: (Co-Lyophilisat quantitativ)
    [0031] - - Plasmamebran aus Rindernebennierenrinde 10mg/Test biologische Ausgangsmasse. - - Tracer: Jod-125 markiertes ANF, ANP (Atrial Natriuretic Factor, Peptide) 20'000 cpm - - Standard ANF (Verdünnungsreihe, nur in einem Teil des Testkits, bspw. l6 von 96 Näpfchen einer Mikrotestplatte. - - Phenanthrol in (Stabilisator) 1 mM - - Farbstoff für die Markierung der Standardreihe: Evans Blue (Konzentration gemäss gewünschter Intensität)
    [0032] Die einzelnen Komponenten werden vorzugsweise im Lyophilisationsmedium (50 mM Tris-Puffer, pH 7.6, 0.5% BSA, 2% Mannit) gelöst und wie oben beschrieben sequentiell eingefroren. Die Lyophilisierung wird gemäss bekannten Verfahren ausge führt, dabei ist darauf zu achten:
    [0033] - - dass sich die eingefrorenen Komponenten auch nicht kurzfristig verflüssigen können;
    [0034] - - dass die Lyophilisation komplett ist und keine Restfeuchtigkeit zurückbleibt;
    [0035] - - der Testbehälter, Röhrchen, Mikrotestplatten werden gleich, nachdem sie aus dem Lyophilisator entnommen werden gegen den Zutritt von Feuchtigkeit abgeschlossen. Vorzugsweise wird der Testbehäl terinhalt mit einem trockenen Inertgas z.B. Stickstoff oder Argon gefüllt.
    [0036] Ein gemäss erfinderischem Verfahren hergestellter Radiorezeptor-Assay zeichnet sich durch folgende Grundzusammensetzung aus:
    [0037] Die rezeptorhal tige Plasmamembranpräparation liegt in lyophilisierter Form vor, wobei die vorgängig zugefügten Trägersubstanzen (Zusatzstoffe) dafür sorgen, dass das Trockengemisch nach erfolgter Rekonsti tution im Assaypuffer sofort und ohne mechanische Einflussnahme (Rühren etc.) in eine homogene Lösung übergeht. Das Lyophilisat zeichnet sich durch eine relativ voluminöse Masse aus, welche vom Fachmann leicht als typisches Lyophilisat erkannt werden kann.
    [0038] Die lyophilisierte Membranpräparation kann sowohl als alleiniger Reaktionsteilnehmer oder als Co-Lyophilisat mit anderen Reaktionstei lehmern vorliegen. Dabei kann in einem Assay-Kit die lyophilisierte Membranpräparation entweder in einem einzigen Gefäss oder aber bereits aliquotiert in den Testbehältern vorliegen. Das Verfahren eignet sich nicht nur für eine Testdurchführung in Röhrchen, sondern eignet sich in hervorragender Weise für den Einsatz von Mikrotestplatten, welche einen hohen Automationsgrad ermöglichen.
    [0039] Ein handelsüblicher Assay-Kit besteht beispielsweise aus einer oder mehreren Mikrotestplatten von je 96 Assays, welche gegen das Eindringen von Feuchtigkeit zum Beispiel mittels dafür geeigneten Klebefolien abgeschlossen sind. Dank der Geometrie von Mikrotestplatten (flacher Körper) kann ein solcher Kit problemlos mittels Briefpost versandt werden. Ausserdem entfällt die bis anhin aufwendige und teure Versandart mit Kühlmittel (Trockeneis).
    权利要求:
    Claims

    PAT ENT A N S P R U E C H E
    1. Verfahren zur Herstellung einer Rezeptorpräparation aus biologisch aktivem Rezeptormaterial, dadurch gekennzeichnet, dass sine Plasmamembranpräparation unter Zusatz von Zuckern und/oder Aminosäuren und/oder Proteinen lyophilisiert wird.
    2. Verfahren nach Anspruch l, gekennzeichnet durch die zu lyophilisierinde wässrige Mischung von Plasmamembranpräparation mit 0.1-10% w/v Mannit, 0.1-1.0% w/v Bovines oder humanes Serumalbumin.
    3. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die zu lyophil isierende wässrige Mischung von Plasmamembranpräparation mit 0.1-10% w/v Glycin, 0.1-1.0% w/v Bovines oder humanes Serumalbumin.
    4. Verfahren nach Anspruchl, dadurch gekennzeichnet, dass zusätzliche Reaktionsteilnehmer zur Erzielung eines einsatzfertigen Assays co-lyophilisiert werden.
    5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die zusätzlichen Reaktionsteilnehmer eine Tracersubstanz und/oder eine Vergleichsstandardsubstanz eines Assay- systems sind.
    6. Verfahren nach den Ansprüchen 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass ausserdem Stabilisatoren und/oder Modulatoren co-lyophilisiert werden.
    7. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Präparation in einem für den Endverbraucher geeigneten Testgefäss lyophilisiert wird.
    8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Testgefäss ein Teströhrchen oder ein Testnäpfchen einer Mi krotestplatte ist.
    9. Rezeptorpräparation, hergestellt nach dem Verfahren von Anspruch 1 , enthaltend Plasmamembran zusammen mit Zuckerverbindungen und/oder Aminosäuren und/oder Proteinen.
    18. Radiorezeptor-Assay hergestellt nach Anspruch 1 und Anspruch 4, enthaltend das Co-Lyophilisat von Plasmamembran zusammen mit Zuckerverbindungen und/oder Aminosäuren und/oder Proteinen und von einer Tracersubstanz und von einer Vergleichsstandardsubstanz.
    11. Radiorezeptor-Assay nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass ausserdem Stabilisatoren und/oder Modulatoren enthalten sind.
    12. Radiorezeptor-Assay nach den Ansprüchen 10 und 11 , gekennzeichnet durch ein Lyophilisat enthaltend:
    Plasmamebran aus biologischer Ausgangsmasse 2-50mg pro Test; Tracer: Jod-125 markiertes ANF, ANP (Atrial Na triuretic Factor, Peptide) 20'000 cpm; Standard ANF (Verdünnungsreihe, nur in einem Teil des Testkits, bspw. 16 von 96 Näpfchen einer Mikrotestplatte; Phenanthrolin (Stabilisator) 1 mM; Farbstoff für die Markierung der
    Standardreihe: Evans Blue (Konzentration gemäss gewünschter Intensität).
    13. Radiorezeptorassay-Kit unter Verwendung des Radiorezpptor-Assays nach Anspruch 10, gekennzeichnet durch:
    eine Mehrzahl von Testbehältern enthaltend ein CoLyophiiisat von Plasmamembran zusammen mit Zuckerverbindungen und/oder Aminosäuren und/oder Proteinen und von einer Tracersubstanz und von einer Vergleichs- standardsubstanz und dass ausserdem Stabilisatoren und/- oder Modulatoren enthalten sind.
    l4. Kit nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Testbehälter Teströhrchen sind.
    15. Kit nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Testbehälter die Näpfchen einer Mikrotestplatte sind.
    16. Verwendung des Kit gemäss Anspruch 13, für den quantitativen oder qualitativen Nachweis von biologisch aktiven
    Substanzen.
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    同族专利:
    公开号 | 公开日
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    AU7917287A|1988-05-06|
    CH676508A5|1991-01-31|
    EP0287581B1|1992-03-25|
    FI882749D0||
    DK272788A|1988-06-08|
    引用文献:
    公开号 | 申请日 | 公开日 | 申请人 | 专利标题
    法律状态:
    1988-04-21| AK| Designated states|Kind code of ref document: A1 Designated state(s): AU DK FI JP NO US |
    1988-04-21| AL| Designated countries for regional patents|Kind code of ref document: A1 Designated state(s): AT BE CH DE FR GB IT LU NL SE |
    1988-06-08| WWE| Wipo information: entry into national phase|Ref document number: 1987905938 Country of ref document: EP |
    1988-06-09| WWE| Wipo information: entry into national phase|Ref document number: 882749 Country of ref document: FI |
    1988-10-26| WWP| Wipo information: published in national office|Ref document number: 1987905938 Country of ref document: EP |
    1992-03-25| WWG| Wipo information: grant in national office|Ref document number: 1987905938 Country of ref document: EP |
    优先权:
    申请号 | 申请日 | 专利标题
    CH407986A|CH676508A5|1986-10-13|1986-10-13||
    CH4079/86-7||1986-10-13||AT87905938T| AT74208T|1986-10-13|1987-09-24|Verfahren zur herstellung einer rezeptorpraeparation fuer einen radiorezeptor-assay und kitgerechter radiorezeptor-assay nach diesem verfahren.|
    DK272788A| DK272788A|1986-10-13|1988-05-18|Fremgangsmaade til fremstilling af et receptorpraeparat til radioreceptoranalysesaet ifoelge fremgangsmaaden|
    FI882749A| FI882749A|1986-10-13|1988-06-09|Foerfarande foer framstaellning av ett receptorpreparat foer radioreceptoranalys och som testfoerpackning laemplig radioreceptoranalys enligt foerfarandet.|
    NO882583A| NO882583L|1986-10-13|1988-06-10|Fremgangsmaate for fremstilling av et reseptorpreparat foren radioreseptorproeve i samavar med fremgangsmaaten.|
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